Test et protocole culture in vitro
Posté : 06 janv. 2013 1:25
Hello tout le monde ;)
Je vais développer ici mon test de culture in vitro petit à petit , il regroupera divers test et info trouvé sur le web ... :D
Utilisation de:
-Une blouse
-Des gants latex
-Une surface de travail propre, désinfectée et sans courant d'air( recouverte d'essuie tout imbibé de javel)
-Un scalpel et une pince
-Une zone stérile (crée à l'aide d'un bec bunsen, d'une hotte à flux laminaire ou d'une glovebox)
-Un masque anti-poussières
-Des récipients (5 béchers, un récipient résistant à la chaleur pour faire chauffé le milieu...)
-De l'alcool à 70° (pour les avant-bras)
-De l'eau de javel
-Des récipients gradués et ou pipette-seringue
-De l'essuie tout
-Du film alimentaire
ETAPE 1 : Préparation de la gélose
Je vais utilisé ici du milieu Murashige & Skoog ( qui est le milieu le plus utilisé)de concentration 10,0 (1000%)
Je souhaite préparer 100mL (environ 30mL par pot bébé) de milieu MS à 33%
Il me faut donc un volume de solution concentré X = (Volume de milieu final souhaité * La concentration en pourcentage du milieu final souhaité)/1000=(100*33)/1000= 3,3 mL
Il me faut une masse d'agar Xa = ( Volume de milieu final souhaité * La concentration d'agar en g/L généralement entre 5 et 7)/1000=(100*7)/1000= 0,7g après un premier test avec une gélose trop molle à 5,6g/L j'ai du rajouté de l'agar donc prenez une concentration plus de 7-8 g/L et j'ai aussi remarqué qu'un refroidissement rapide de la gélose après stérilisation la rendait plus ferme.
Il me faut une masse de sucre Xs = ( Volume de milieu final souhaité * La concentration de sucre en g/L )/1000=(100*25)/1000= 2,5g
A tout cela ajouté la moitié du Volume de milieu final souhaité en eau déminéralisée stérile donc ici 50ml;
y ajouter les inhibiteurs comme la PPM "Plant Preservative Mixture" ( environ 1mL/L de Volume de milieu final souhaité )et autres hormones...
Ajuster toujours avec de l'eau déminéralisée stérile jusqu'au Volume de milieu final souhaité ici 100mL et ajuster le ph à l'aide d'une solution basique (une cuillère à soupe de bicarbonate de soude dissous dans une solution de 20 ml d'eau) ou acide (5 ml de vinaigre mélangé avec 25 ml d'eau) sachant que le pH optimum est compris entre 5 et 6.
Chauffer au bain marie la solution (ou un chauffe ballon), lorsque le liquide est semi-transparent, il est prêt à être versé dans les récipients préalablement lavé avec de la javel dilué à 20% à raison de 1cm de hauteur pour un semi à 2-3cm pour un repiquage.
Stérilisation 20 à 30 min à partir du moment ou la cocotte minute siffle; ne pas dépasser cette durée pour ne pas détruire les éléments les plus fragiles présents dans la gélose comme les vitamines ou à l’autoclave (25 mn à 115°C ou 20 mn à 120°C).. Placer environ 2L d'eau au fond de la cocotte minute et placer les bocaux de gélose dans le panier, ils ne doivent pas être en contact avec l'eau ou la paroi.
Laisser refroidir sans enlever la soupape ( pendant environ 3h)
A ce moment là vous pouvez laisser votre gélose à la lumière pendant une dizaine de jours pour faire un test de contamination ou alors directement passé à l'étape suivant ;)
ETAPE 2 : Stérilisation des graines ou des fragments de tissus (L'installation)
Avant toutes choses pour les graines on peut utiliser du papier filtre afin de pouvoir repêcher plus facilement les graines une fois trempé dans les différente solutions
Nous avons ici besoin de 5 béchers:
_ bécher 1 : Le mouillant, c'est une solution d'eau déminéralisé stérilisée et de liquide vaisselle qui a pour rôle de nettoyer les graines ou fragments afin de facilité une meilleur stérilisation par la suite. On peut aussi utiliser du mercryl laurylé qui est à la fois un désinfectant et mouillant ou alors de l'éthanol.
_ bécher 2 : Le stérilisant, c'est une solution contenant un produit chimique permettant de détruire les germes ( bactéries, champignons, virus)
*Différent stérilisant pouvant être utiliser:
_ Eau de javel 1/5 ou 1/10(5-8 min pour les graines de drosera, pour les fragments de tissus: jusqu'à ce que les bords du tissus coupé blanchissent puis recouper avant rinçage )
_ Hypochlorite de calcium 1 à 10% (ne nécessite pas de rinçage)( 7 min à 5% pour des graines de dionaea)
_ NaDCC 1,7g/L( ce que je vais utilisé, contient un peu moins de chlore actif que l'hypochlorite de calcium mais à l'avantage d'être plus stable)
_ Alcool à 70% ( pas d'effet fongique, il est donc utilisé en complément dans un bécher 2bis )
(3min pour des graines de dionaea)
_ Domestos (nettoyant wc ) dilué à 10% (résultat positif trempage 10min pour les tissus) ou 70% (résultat négatif, contamination)....
Tableau des valeurs pour NaDCC 1000ppm 1,7g/L
_bécher 3,4,5: Le rinçage, il s'effectue dans 3 béchers remplient d'eau déminéralisée stérile, on peut aussi utiliser des solution d'inhibiteur faiblement concentré ( exemple PPM 0,5%) puis placer au micro onde à la limite de l’ébullition avant usage
J'ai aussi trouvé 2 autres méthodes utilisées pour les cactus (article publié par Mélanie Quennoz le 11/11/2001 http://www.cactuspro.com/articles/la_cu ... emiers_pas) à noté l'utilisation d' HgCl2 très toxique et très difficile à trouver donc je vous le déconseille.
"Méthode 1
Matériel
Eau stérile
Papiers-Filtres non stériles
Agrafeuse
Un bécher (ou récipient servant de poubelle)
Une minuterie
Solution à 0.8 % de Javel, contenant 2 gouttes de mouillant (Triton, teepol, liquide vaisselle,…)
Solution à 3 % de Kohrsolin (Bode) liquide de désinfection du sol.
Alcool 70%
Méthode
Placer les graines dans un sachet fait à partir de papier-filtre plié et agrafé.
Mouiller le sachet dans un bain d'alcool 70 %.
Placer le sachet dans le mélange Javel 0.8 % + mouillant pendant 15 à 20 minutes et agiter de temps en temps.
Vider la Javel, rincer une fois le sachet à l'eau stérile.
Placer le sachet dans le bain de Kohrsolin 3% durant 15 à 20 minutes et agiter de temps en temps.
Vider le récipient et rincer trois fois à l'eau stérile. Chaque rinçage durant plusieurs minutes.
Placer les graines sur milieu de culture.
Attention, ne rien écrire sur les sachets, tout s'efface !
Installation de boutures :
Le principe est le même, des bourgeons avec suffisamment de tissus sont placés dans l'alcool, puis dans la javel, puis dans le Kohrsolin et enfin rincés. Ensuite, ils sont retaillés et placés sur milieu de culture.
Méthode 2
Matériel
Eau stérile
Alcool 70%
Solution à 0.2% de HgCl2
Méthode
Laver les boutures à l'eau courante.
Les placer dans l'alcool à 70% durant 45 secondes.
Les placer dans la solution de HgCl2 pour 3 minutes.
Rincer cinq fois à l'eau stérile.
Rafraîchir les surfaces de coupe et placer les boutures sur leur milieu de culture, la coupe touchant le milieu."
Une fois la stérilisation faite pour les fragments il faut les recouper avec un scalpel pour éliminer les tissus qui n'ont pas survécu (en blanc)
Il ne vous reste plus qu'a les placer dans les contenants en étant bien sur dans un milieu stérile grâce à l'usage d'un bec bunsen, d'une hotte à flux laminaire ou d'une glovebox ;)
Les "Hormones végétales" :
Ce sont des régulateurs de croissance et/ou de différenciation cellulaire, ils ont donc une action stimulante.
Il faut toutefois prendre des précaution car ce sont des molécules qui agissent à faible dose pour notre usage ( à forte dose elles ont été utilisé comme herbicide), aucune hormones n'a d'actions spécifiques et leurs actions est corroboré avec la présence d'autres hormones, celle-ci peut donc varier, les informations ci-dessous sont donc des généralités.
-Les auxines ou AIA (Acide Indole Acétique):(Substances similaire: acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, acide indole-3-acétique, acide indole-3-butyrique, acide 1-naphthalèneacétique,...) Sa synthèse a principalement lieu dans le méristème apical des pousses (groupe de cellules non différenciées, sans fonction autre que de se diviser et participer ainsi à la croissance de la plante) et en descendant dans la plante elle est à l'origine de la dominance apical en inhibant la croissance des bourgeons latéraux. Les auxines sont aussi à l'origine du phototropisme (capacité qu'a la partie aérienne d'une plante à se tourner vers la lumière)et du géocentrisme (capacité qu'a la partie souterraine d'une plante à se tourner vers le sol)
*allongement cellulaire
*callogenèse (cal=amas de cellules indifférenciées)
*rhizogénèse (formation de racines)
*différenciation cellulaire
*fructification ( à l'état naturel ce sont les graines qui produisent des auxines et fond murir le fruit, en pulvérisant des auxines sur un pied de tomate on peut obtenir des fruits sans graines car ils ne sont pas lié à une pollinisation)
-Les gibbérellines : Ces hormones agissent de la même manières mais de façon plus ou moins importante, elles sont produites dans les jeunes feuilles et les racines
*augmentation de la distance inter-noeuds
*croissance des méristèmes
*stimulation sur le métabolisme et la production d'auxine
*favorisent la germination et permet de sortir de dormance des bourgeons
*stimulation de la fructification et de la floraison
-Les cytokinines : (Substances similaire: zéatine, BAP, kinétine,...) Elles sont produites dans les tissus en croissance active (principalement dans les racines, embryons, fruits ). "En culture in vitro, leurs effets sont liés à ceux de l'auxine. On cultive un morceau de tige sans hormone, les cellules deviennent très grosses mais ne se divisent pas, si on ajoute une cytokinine, rien ne se passe, mais si on ajoute la même quantité d'auxine, les cellules se divisent, mais restent indifférenciées, on obtient un cal. S'il y a plus de cytokinines, le cal se différencie et des bourgeons apparaissent, s'il y a plus d'auxines, des racines se forment. Elles inhibent les auxines, provoquent la ramification, retardent la sénescence (on en pulvérise sur les fleurs coupées pour conserver leur fraîcheur)." (article publié par Mélanie Quennoz le 11/11/2001 http://www.cactuspro.com/articles/la_cu ... emiers_pas))
*favorise la division cellulaire en présence d'auxine
*organogénèse (favorise la formation de bourgeons)
*inhibe la rhizogénèse
*stimulation sur le métabolisme
*permet d’empêcher la dominance apicale
-L'acide abscissique ou ABA ( de l'anglais abscissic acid): Production dans les bourgeons et le rapport gibbérellines / acide abscissique fait partit des facteurs de germination des graines.
*inhibe la croissance
*freine la division cellulaire
*ferme les stomates en période de sécheresse
*déclenche la dormance
-L'éthylène : C'est la seule hormone végétale sous forme gazeuse.
*inhibe la croissance
*lié aux processus de vieillissement comme la chute des feuilles
*favorise la maturation des fruits (en dégradant la paroi des cellules et en bloquant la synthèse de la chlorophylle) et la floraison chez certaines plantes
Selon Skoog ( qui a donné son nom au milieu) le comportement d'un explant face à différente concentration entre auxine et cytokinine est le suivant:
*Si le rapport auxine/cytokinine est élevé on favorise la rhizogénèse.
*Si le rapport auxine/cytokinine est faible l'explant évoluera vers une fonction caulogène (formation de bourgeons).
*Si le rapport est voisin de l'unité on aura un comportement callogène.
Tableau pourcentage MS et phytohormone par espèces
Et pour finir ma trombine en pleine action elle est pas à mon avantage prolongation des fêtes de fin d'année oblige mais bon j'allais pas me rhabiller en clown pour votre plaisir !
J’espère que ce petit récapepette vous aura plus !
Je vous ferais sans doute des photos pour illustré tout ça ;)
Pour les commentaires et les conseils n'hésitez pas ! sachant que c'est mon premier essaie ;)
Fred
Je vais développer ici mon test de culture in vitro petit à petit , il regroupera divers test et info trouvé sur le web ... :D
Utilisation de:
-Une blouse
-Des gants latex
-Une surface de travail propre, désinfectée et sans courant d'air( recouverte d'essuie tout imbibé de javel)
-Un scalpel et une pince
-Une zone stérile (crée à l'aide d'un bec bunsen, d'une hotte à flux laminaire ou d'une glovebox)
-Un masque anti-poussières
-Des récipients (5 béchers, un récipient résistant à la chaleur pour faire chauffé le milieu...)
-De l'alcool à 70° (pour les avant-bras)
-De l'eau de javel
-Des récipients gradués et ou pipette-seringue
-De l'essuie tout
-Du film alimentaire
ETAPE 1 : Préparation de la gélose
Je vais utilisé ici du milieu Murashige & Skoog ( qui est le milieu le plus utilisé)de concentration 10,0 (1000%)
Je souhaite préparer 100mL (environ 30mL par pot bébé) de milieu MS à 33%
Il me faut donc un volume de solution concentré X = (Volume de milieu final souhaité * La concentration en pourcentage du milieu final souhaité)/1000=(100*33)/1000= 3,3 mL
Il me faut une masse d'agar Xa = ( Volume de milieu final souhaité * La concentration d'agar en g/L généralement entre 5 et 7)/1000=(100*7)/1000= 0,7g après un premier test avec une gélose trop molle à 5,6g/L j'ai du rajouté de l'agar donc prenez une concentration plus de 7-8 g/L et j'ai aussi remarqué qu'un refroidissement rapide de la gélose après stérilisation la rendait plus ferme.
Il me faut une masse de sucre Xs = ( Volume de milieu final souhaité * La concentration de sucre en g/L )/1000=(100*25)/1000= 2,5g
A tout cela ajouté la moitié du Volume de milieu final souhaité en eau déminéralisée stérile donc ici 50ml;
y ajouter les inhibiteurs comme la PPM "Plant Preservative Mixture" ( environ 1mL/L de Volume de milieu final souhaité )et autres hormones...
Ajuster toujours avec de l'eau déminéralisée stérile jusqu'au Volume de milieu final souhaité ici 100mL et ajuster le ph à l'aide d'une solution basique (une cuillère à soupe de bicarbonate de soude dissous dans une solution de 20 ml d'eau) ou acide (5 ml de vinaigre mélangé avec 25 ml d'eau) sachant que le pH optimum est compris entre 5 et 6.
Chauffer au bain marie la solution (ou un chauffe ballon), lorsque le liquide est semi-transparent, il est prêt à être versé dans les récipients préalablement lavé avec de la javel dilué à 20% à raison de 1cm de hauteur pour un semi à 2-3cm pour un repiquage.
Stérilisation 20 à 30 min à partir du moment ou la cocotte minute siffle; ne pas dépasser cette durée pour ne pas détruire les éléments les plus fragiles présents dans la gélose comme les vitamines ou à l’autoclave (25 mn à 115°C ou 20 mn à 120°C).. Placer environ 2L d'eau au fond de la cocotte minute et placer les bocaux de gélose dans le panier, ils ne doivent pas être en contact avec l'eau ou la paroi.
Laisser refroidir sans enlever la soupape ( pendant environ 3h)
A ce moment là vous pouvez laisser votre gélose à la lumière pendant une dizaine de jours pour faire un test de contamination ou alors directement passé à l'étape suivant ;)
ETAPE 2 : Stérilisation des graines ou des fragments de tissus (L'installation)
Avant toutes choses pour les graines on peut utiliser du papier filtre afin de pouvoir repêcher plus facilement les graines une fois trempé dans les différente solutions
Nous avons ici besoin de 5 béchers:
_ bécher 1 : Le mouillant, c'est une solution d'eau déminéralisé stérilisée et de liquide vaisselle qui a pour rôle de nettoyer les graines ou fragments afin de facilité une meilleur stérilisation par la suite. On peut aussi utiliser du mercryl laurylé qui est à la fois un désinfectant et mouillant ou alors de l'éthanol.
_ bécher 2 : Le stérilisant, c'est une solution contenant un produit chimique permettant de détruire les germes ( bactéries, champignons, virus)
*Différent stérilisant pouvant être utiliser:
_ Eau de javel 1/5 ou 1/10(5-8 min pour les graines de drosera, pour les fragments de tissus: jusqu'à ce que les bords du tissus coupé blanchissent puis recouper avant rinçage )
_ Hypochlorite de calcium 1 à 10% (ne nécessite pas de rinçage)( 7 min à 5% pour des graines de dionaea)
_ NaDCC 1,7g/L( ce que je vais utilisé, contient un peu moins de chlore actif que l'hypochlorite de calcium mais à l'avantage d'être plus stable)
_ Alcool à 70% ( pas d'effet fongique, il est donc utilisé en complément dans un bécher 2bis )
(3min pour des graines de dionaea)
_ Domestos (nettoyant wc ) dilué à 10% (résultat positif trempage 10min pour les tissus) ou 70% (résultat négatif, contamination)....
Tableau des valeurs pour NaDCC 1000ppm 1,7g/L
_bécher 3,4,5: Le rinçage, il s'effectue dans 3 béchers remplient d'eau déminéralisée stérile, on peut aussi utiliser des solution d'inhibiteur faiblement concentré ( exemple PPM 0,5%) puis placer au micro onde à la limite de l’ébullition avant usage
J'ai aussi trouvé 2 autres méthodes utilisées pour les cactus (article publié par Mélanie Quennoz le 11/11/2001 http://www.cactuspro.com/articles/la_cu ... emiers_pas) à noté l'utilisation d' HgCl2 très toxique et très difficile à trouver donc je vous le déconseille.
"Méthode 1
Matériel
Eau stérile
Papiers-Filtres non stériles
Agrafeuse
Un bécher (ou récipient servant de poubelle)
Une minuterie
Solution à 0.8 % de Javel, contenant 2 gouttes de mouillant (Triton, teepol, liquide vaisselle,…)
Solution à 3 % de Kohrsolin (Bode) liquide de désinfection du sol.
Alcool 70%
Méthode
Placer les graines dans un sachet fait à partir de papier-filtre plié et agrafé.
Mouiller le sachet dans un bain d'alcool 70 %.
Placer le sachet dans le mélange Javel 0.8 % + mouillant pendant 15 à 20 minutes et agiter de temps en temps.
Vider la Javel, rincer une fois le sachet à l'eau stérile.
Placer le sachet dans le bain de Kohrsolin 3% durant 15 à 20 minutes et agiter de temps en temps.
Vider le récipient et rincer trois fois à l'eau stérile. Chaque rinçage durant plusieurs minutes.
Placer les graines sur milieu de culture.
Attention, ne rien écrire sur les sachets, tout s'efface !
Installation de boutures :
Le principe est le même, des bourgeons avec suffisamment de tissus sont placés dans l'alcool, puis dans la javel, puis dans le Kohrsolin et enfin rincés. Ensuite, ils sont retaillés et placés sur milieu de culture.
Méthode 2
Matériel
Eau stérile
Alcool 70%
Solution à 0.2% de HgCl2
Méthode
Laver les boutures à l'eau courante.
Les placer dans l'alcool à 70% durant 45 secondes.
Les placer dans la solution de HgCl2 pour 3 minutes.
Rincer cinq fois à l'eau stérile.
Rafraîchir les surfaces de coupe et placer les boutures sur leur milieu de culture, la coupe touchant le milieu."
Une fois la stérilisation faite pour les fragments il faut les recouper avec un scalpel pour éliminer les tissus qui n'ont pas survécu (en blanc)
Il ne vous reste plus qu'a les placer dans les contenants en étant bien sur dans un milieu stérile grâce à l'usage d'un bec bunsen, d'une hotte à flux laminaire ou d'une glovebox ;)
Les "Hormones végétales" :
Ce sont des régulateurs de croissance et/ou de différenciation cellulaire, ils ont donc une action stimulante.
Il faut toutefois prendre des précaution car ce sont des molécules qui agissent à faible dose pour notre usage ( à forte dose elles ont été utilisé comme herbicide), aucune hormones n'a d'actions spécifiques et leurs actions est corroboré avec la présence d'autres hormones, celle-ci peut donc varier, les informations ci-dessous sont donc des généralités.
-Les auxines ou AIA (Acide Indole Acétique):(Substances similaire: acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, acide indole-3-acétique, acide indole-3-butyrique, acide 1-naphthalèneacétique,...) Sa synthèse a principalement lieu dans le méristème apical des pousses (groupe de cellules non différenciées, sans fonction autre que de se diviser et participer ainsi à la croissance de la plante) et en descendant dans la plante elle est à l'origine de la dominance apical en inhibant la croissance des bourgeons latéraux. Les auxines sont aussi à l'origine du phototropisme (capacité qu'a la partie aérienne d'une plante à se tourner vers la lumière)et du géocentrisme (capacité qu'a la partie souterraine d'une plante à se tourner vers le sol)
*allongement cellulaire
*callogenèse (cal=amas de cellules indifférenciées)
*rhizogénèse (formation de racines)
*différenciation cellulaire
*fructification ( à l'état naturel ce sont les graines qui produisent des auxines et fond murir le fruit, en pulvérisant des auxines sur un pied de tomate on peut obtenir des fruits sans graines car ils ne sont pas lié à une pollinisation)
-Les gibbérellines : Ces hormones agissent de la même manières mais de façon plus ou moins importante, elles sont produites dans les jeunes feuilles et les racines
*augmentation de la distance inter-noeuds
*croissance des méristèmes
*stimulation sur le métabolisme et la production d'auxine
*favorisent la germination et permet de sortir de dormance des bourgeons
*stimulation de la fructification et de la floraison
-Les cytokinines : (Substances similaire: zéatine, BAP, kinétine,...) Elles sont produites dans les tissus en croissance active (principalement dans les racines, embryons, fruits ). "En culture in vitro, leurs effets sont liés à ceux de l'auxine. On cultive un morceau de tige sans hormone, les cellules deviennent très grosses mais ne se divisent pas, si on ajoute une cytokinine, rien ne se passe, mais si on ajoute la même quantité d'auxine, les cellules se divisent, mais restent indifférenciées, on obtient un cal. S'il y a plus de cytokinines, le cal se différencie et des bourgeons apparaissent, s'il y a plus d'auxines, des racines se forment. Elles inhibent les auxines, provoquent la ramification, retardent la sénescence (on en pulvérise sur les fleurs coupées pour conserver leur fraîcheur)." (article publié par Mélanie Quennoz le 11/11/2001 http://www.cactuspro.com/articles/la_cu ... emiers_pas))
*favorise la division cellulaire en présence d'auxine
*organogénèse (favorise la formation de bourgeons)
*inhibe la rhizogénèse
*stimulation sur le métabolisme
*permet d’empêcher la dominance apicale
-L'acide abscissique ou ABA ( de l'anglais abscissic acid): Production dans les bourgeons et le rapport gibbérellines / acide abscissique fait partit des facteurs de germination des graines.
*inhibe la croissance
*freine la division cellulaire
*ferme les stomates en période de sécheresse
*déclenche la dormance
-L'éthylène : C'est la seule hormone végétale sous forme gazeuse.
*inhibe la croissance
*lié aux processus de vieillissement comme la chute des feuilles
*favorise la maturation des fruits (en dégradant la paroi des cellules et en bloquant la synthèse de la chlorophylle) et la floraison chez certaines plantes
Selon Skoog ( qui a donné son nom au milieu) le comportement d'un explant face à différente concentration entre auxine et cytokinine est le suivant:
*Si le rapport auxine/cytokinine est élevé on favorise la rhizogénèse.
*Si le rapport auxine/cytokinine est faible l'explant évoluera vers une fonction caulogène (formation de bourgeons).
*Si le rapport est voisin de l'unité on aura un comportement callogène.
Tableau pourcentage MS et phytohormone par espèces
Et pour finir ma trombine en pleine action elle est pas à mon avantage prolongation des fêtes de fin d'année oblige mais bon j'allais pas me rhabiller en clown pour votre plaisir !
J’espère que ce petit récapepette vous aura plus !
Je vous ferais sans doute des photos pour illustré tout ça ;)
Pour les commentaires et les conseils n'hésitez pas ! sachant que c'est mon premier essaie ;)
Fred